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利用飛行時間核酸質(zhì)譜定量檢測超微量樣本中核酸表觀修飾的新方法LAMP-MS

2025年03月28日 16:15 來源：聚光科技（杭州）股份有限公司
2024年11月4日，國際化學(xué)類頂級期刊《德國應(yīng)用化學(xué)國際版》（Angewandte Chemie-international Edition）（IF 16.1）上發(fā)表了題為《LAMP-MS for Locus-Specific Visual Quantification of DNA 5mC and RNA m6A Using Ultra-Low Input》的研究論文。報道了一種基于核酸質(zhì)譜平臺的創(chuàng)新甲基化檢測方法，該工作由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院胡璐璐研究員團隊、華山醫(yī)院消化科劉杰主任團隊、美國芝加哥大學(xué)何川院士團隊攜手柏锘（上海）醫(yī)療科技有限公司共同完成。



該研究中所使用的飛行時間質(zhì)譜平臺為聚光科技生命科學(xué)板塊旗下聚致生物（GenWish）自主研發(fā)的GeneTOF 3100核酸質(zhì)譜分析系統(tǒng)。

利用飛行時間核酸質(zhì)譜定量檢測超微量樣本中核酸表觀修飾的新方法LAMP-MS

液體活檢技術(shù)通過收集血液中來自各種組織的游離DNA（cfDNA），對其中包含的生物標(biāo)志物（如基因突變、甲基化或羥甲基等表觀修飾）進行檢測，具有無創(chuàng)、高效的特點。與傳統(tǒng)的各種檢測技術(shù)（例如胃腸鏡、血清標(biāo)志物）相比，液體活檢在臨床上具有革命性的優(yōu)勢，在癌癥等疾病的早篩早診、預(yù)后監(jiān)測、療效評估等諸多方面有廣闊的應(yīng)用前景。

DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，可在腫瘤發(fā)生的早期被檢測到，且具有較好的穩(wěn)定性，因此成為腫瘤液體活檢中一個生物標(biāo)志物。但是，目前基于亞硫酸氫鹽測序技術(shù)的甲基化檢測方法，很難避免DNA的降解；且高通量測序成本較高，實驗后的分析工作復(fù)雜；PCR檢測涵蓋的位點也有限，因此開發(fā)一種經(jīng)濟、可靠、通量靈活且能夠覆蓋多位點的新甲基化檢測方法，是非常具有意義的。

研究團隊開發(fā)的LAMP-MS方法創(chuàng)造性地將線性擴增和飛行時間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合在一起，只需要1ng血漿cfDNA，通過多重PCR和單堿基引物延伸，能夠在較短時間內(nèi)同時檢測數(shù)十個甲基化位點。該技術(shù)主要操作步驟如圖1所示：


LAMP-MS的完整工作流程


  • 從血漿中提取1ng的cfDNA樣本，經(jīng)過末端修復(fù)后，用含有甲基化雙鏈T7啟動子的DNA接頭進行連接；




  • 進行亞硫酸氫鹽處理后，非甲基化的胞嘧啶（dC）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（dU），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不變；

  • 使用T7 RNA聚合酶進行無偏好性線性擴增，產(chǎn)生μg數(shù)量級的RNA產(chǎn)物；

  • 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生微克水平的cDNA；

  • 通過序列特異性PCR對含有特定DNA甲基化位點的DNA片段進行指數(shù)擴增；

  • 對特定的DNA片段進行文庫構(gòu)建和淺測序（1~2G深度），稱為靶向LAMP-Seq，以確定5mC的化學(xué)計量；

  • 利用位點特異性引物進行單堿基延伸，如果延伸位點配對的是ddATP，代表此處為未甲基化的C，如果是ddGTP則代表甲基化的5mC，通過相應(yīng)的質(zhì)譜峰計算 5mC/C 比值。



為驗證LAMP-MS方法的性能，研究團隊合成了含有0%、5%、10%、25%、50%、75%及100% 5mC的一系列DNA探針混合物，利用1ng的上述探針混合物對LAMP-MS方法進行測試。結(jié)果表明，LAMP-MS能夠準(zhǔn)確地定量測量從0%到100%的5mC（圖2A），圖2B中標(biāo)曲表明檢測準(zhǔn)確性和理論值高度吻合。此外，文章表示，LAMP-MS在1ng探針混合物體系下的檢測限為5%的5mC的甲基化率（圖2B）。

圖2A 使用1ng 5mC探針驗證LAMP-MS方法的靈敏度和準(zhǔn)確性

圖2B 使用1ng 5mC探針驗證LAMP-MS方法的靈敏度和準(zhǔn)確性

在臨床上，來自癌癥患者血漿cfDNA樣本的生物標(biāo)志物豐度因人而異，因此研究團隊進一步利用真實樣本對LAMP-MS方法進行了驗證。從10名結(jié)直腸癌患者和10名非結(jié)直腸癌患者中各獲取1ng的cfDNA樣本，檢測了結(jié)直腸癌篩查中有代表性的標(biāo)志物——SEPTIN9基因的4個甲基化位點，發(fā)現(xiàn)LAMP-MS能夠準(zhǔn)確測定四個 SEPTIN9 位點的 5mC 甲基化率，且結(jié)直腸癌組和非結(jié)直腸癌組之間存在顯著差異，與高通量測序結(jié)果有很好的一致性（圖3）。

圖3 在結(jié)直腸癌和非結(jié)直腸癌患者中驗證LAMP-MS方法

研究團隊認(rèn)為，同樣的策略也可以拓展到RNA的定量檢測中，例如在大多數(shù)高等生物mRNA中含量豐富、并且對于生命過程起著重要調(diào)節(jié)作用的m6A修飾的檢測。

研究團隊將已發(fā)表的GLORI技術(shù)和核酸質(zhì)譜有機整合成為m6A Mass Array方法。該方法從HELA細(xì)胞中提取mRNA，將未甲基化的腺嘌呤轉(zhuǎn)化為肌苷，甲基化的m6A則保留下來。經(jīng)過末端修復(fù)、加接頭，再將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為模板進行指數(shù)擴增，然后在m6A位點進行單堿基延伸，若延伸ddATP則對應(yīng)檢測位點為m6A，ddGTP對應(yīng)未甲基化的腺嘌呤。從而能夠計算出該位點的 m6A/A 比率。

對比HELA細(xì)胞mRNA中RXRA基因（100% m6A），TNFRSF10B基因（100% m6A）和FBXL19基因（53% m6A），及其各自鄰近的非甲基化腺嘌呤位點，證明該m6A核酸質(zhì)譜方法能夠進行有效的RNA甲基化定量檢測（圖4） 。

圖4 m6A核酸質(zhì)譜方法：流程及驗證

綜上所述，LAMP-MS（及m6A MASS ARRAY方法）基于核酸質(zhì)譜技術(shù)，可以實現(xiàn)超低量樣本的甲基化檢測，且結(jié)果可以直接可視化，不需要高通量測序繁復(fù)的數(shù)據(jù)分析處理過程；該技術(shù)利用核酸質(zhì)譜前處理體系，在單反應(yīng)中可實現(xiàn)檢測多個5mC位點的檢測，且具有良好的特異性，在臨床上可用于同時篩查多種癌癥類型的標(biāo)志物；并且，質(zhì)譜檢測也具有靈敏度和精密度的特點，能夠在極低樣本量下提供高度可靠的分析結(jié)果，是低豐度變異標(biāo)志物檢測的理想平臺；最后，核酸質(zhì)譜通量靈活，無需湊樣，能夠從容應(yīng)對大樣本量的臨床驗證工作或小樣本量的研究工作。

因此，LAMP-MS技術(shù)有潛力作為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域重要的實用工具，為科研工作者的實驗室研究和臨床樣本檢測提供了經(jīng)濟且先進的應(yīng)用方案。


聚致生物核酸質(zhì)譜平臺

GeneTOF系列核酸質(zhì)譜分析系統(tǒng)是準(zhǔn)確、經(jīng)濟、高效的多重自動化基因檢測平臺，能夠在單反應(yīng)中實現(xiàn)1~50個基因位點變異靶標(biāo)的精確檢測，變異類型包括SNP突變、甲基化、拷貝數(shù)變異、基因融合、堿基插入/缺失等。在腫瘤防治、出生缺陷防控、藥物基因組、病原體檢測等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

聚致生物

杭州聚致生物科技有限公司（簡稱“聚致生物”）創(chuàng)立于2021年，總部位于浙江杭州，是國內(nèi)儀器裝備企業(yè)——聚光科技生命科學(xué)旗下子公司，專注于生物質(zhì)譜類及相關(guān)儀器產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和推廣，致力于以先進分析技術(shù)推動生命科學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，共建良好的產(chǎn)業(yè)生態(tài)。

聚致生物定位于上游儀器平臺供應(yīng)商，以開放的態(tài)度同生命科學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)機構(gòu)合作，共同培育終端應(yīng)用市場，造福人類的美好生活。

聚致生物產(chǎn)品

GeneTOF系列 核酸質(zhì)譜分析系統(tǒng)


MEC-1000 核酸片段分析儀


關(guān)鍵詞： 聚光科技

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