蛋白質作為所有生命周期的直接參與者，是生命現象和生物規律 變化的標志物，在生命科學的大環節中占據著舉足輕重的地位。 從蛋白質的角度去描述生物的變化，業已成為研究生命科學的主 要手段。處于不同時期、不同條件下的功能性蛋白質，其表現 形式及豐度水平千變萬化、生理功能模塊和介導信號通路紛繁復 雜，因此，深入研究蛋白質乃至對生物標志物監測充滿著艱辛與 挑戰。與早期關注蛋白質的發現過程不一樣，目前生物化學家越 來越重視功能性蛋白質在表達量上的變化，蛋白豐度的變化更能 體現出生命變化的多樣性。生化實驗室最根本的分析任務之一就是蛋白的定量分析，但以往 的抗體免疫化學法 (Western Blot) 表現出較差的特異性和較高的 測量誤差 (CV > 20 - 40%)。串聯質譜多反應監測 (MRM/SRM) 定量方法，一直以來就是定量的黃金標準，在小分子定量上早已 成熟使用，隨著液相色譜和串聯質譜技術的提高，越來越多的生化實驗室開始大量采用串聯質譜技術為基礎的蛋白（肽段）定量 流程。MRM 肽段定量方法的優點很多，它利用蛋白專屬的肽段 序列完成定量分析，一次運行可同時分析幾十到幾百種的蛋白， 具備高通量的定量分析能力。特別是 2012 年，領域的期刊《Nature Methods》將基于三重四極桿質譜 平臺的 MRM/SRM 定量思路的靶向蛋白質組學 (Targeted proteomics) 技術列為當年的年度方法，確立了目標蛋白定量分析的策略。近年來該雜志陸續發表了多篇論文，對 三重四級桿-MRM/SRM 思 路成功應用于目標蛋白定量分析進行了持續報道。隨著質譜靈敏 度的大幅提高，以大流速常規液相色譜 (LC) 取代納流液相色譜 (Nano-LC) 所組成的 MRM 肽段定量方法，代表著蛋白定量分析 的最高技術標準，促進生物化學及各種新應用快速向前發 展，廣泛應用在蛋白質組學、生物制藥等研究領域，并迅速朝著 諸如食品、環境、臨床等更寬的應用范圍發展。

MRM 方法作為一種成熟的定量技術，已經廣泛用于食品安全檢 測和制藥行業以及肽段的檢測。以制藥為例，MRM 方法被用來 監測血樣中藥物濃度或藥物代謝產物隨時間的變化。基于質譜 技術的蛋白質組學常用的一種分析策略是采用特異性蛋白酶將蛋 白質酶切形成肽段，生成的肽段經過液相色譜分離后進入質譜分 析，通過鑒定蛋白對應的唯yi性肽段 (Unique Peptides) 來鑒定 相應的蛋白，該方法被稱為niao槍法 (Shotgun)，是蛋白質組學經 典的非靶向方法。該方法被廣泛用于復雜生物樣本，如血漿、細 胞、組織中蛋白的大規模鑒定，采用標記或非標記的方式通過相 對定量比較對照組和樣品組的差異可以發現具有診斷、預警或治 療有意義的潛在蛋白質，即生物標記物。僅以癌癥為例，目前文 獻報道的潛在生物標記物就超過 1261 個[1]。然而，這其中幾乎 沒有一個潛在生物標記物能滿足臨床生物標記物的高標準而被認 可，這一點從美國 FDA 批準蛋白類生物標記物的進度就能證實。 過去 15 年，美國 FDA 批準的針對所有疾病的生物標記物平均下 來每年不超過 1.5 個蛋白[2]。在臨床上，目前使用的生物標記物 的體內濃度低、動態范圍寬，濃度分布能跨越 11 個數量級；在分 析方法上又缺少一種能對大量不同樣品進行精準定量的高通量分 析方法。而 MRM 方法能彌補niao槍法的不足，提供了一種高靈敏 度、高精確度、高重現性和高通量的分析方法，非常適用于生物 標記物的驗證及系統生物學研究[3]。

MRM 方法充分發揮了 三重四級桿定量的優勢。在 MRM 方法中，通 過采用 Q1 和 Q3 分別選擇目標肽段的母離子和子離子來實現對 應目標蛋白的精確定量。兩級四極桿篩選為 MRM 方法提供了極 高的選擇性，降低了復雜樣品中共流出物的背景干擾[4]。同時， 三重四級桿方法采用選擇離子通過模式，相比于niao槍法的傳統全掃描模 式，方法的靈敏度提高了 1 - 2 個數量級。另外，MRM 具有五 個數量級的線性動態范圍，能夠檢測復雜樣品中的低豐度蛋白， 這在系統生物學定量研究中至關重要。MRM 檢測肽段方法建 立后，在不同的實驗室里重復實驗具有非常好的重現性；一個方 法內可包含上千個 MRM 離子對，能實現高通量的檢測[5]。通過 加入穩定同位素標記內標肽段 (Stable Isotope-labeled internal standards, SIS)，可以大大降低離子抑制、基質效應和樣品前處 理過程的誤差造成的影響，得到更準確的定量結果。對于一組給 定的待測蛋白質，如信號通路上蛋白質、一組生物標記物，MRM 方法能夠進行一致的、可重復的、高通量的精準定量分析[6]。相 比于親和方法，MRM 不受到抗體種類及特異性的限制，能夠很 方便的進行大規模研究。 目前靶向肽段定量的蛋白測定法，可以開展大規模的蛋白質組學 定量分析項目，以及在大規模地開發、系統性地驗證蛋白質生物 標志物；加之快速成熟的分析方法和軟件，以及廣泛接受和普遍 使用的質譜儀器，為生物化學家提供了系統、可靠、革命性的蛋 白定量平臺，促進了系統生物學、臨床研究、生物制藥及 其它相關應用領域的高速發展。

 MRM 肽段定量的完整流程包含如下 6 個模塊：① 獲取靶 蛋白序列，② 選擇特異序列肽段（Skyline 軟件），③ 構建 MRM 離子對及參數優化（Skyline 軟件或安捷倫 optimizer 軟件），④ 樣品處理及制備，⑤三重四級桿數據采集及 ⑥ 分析結果（安捷倫 MassHunter 定量軟件或 Skyline 軟件）。 簡單介紹一下這六大模塊。首先，① 從實驗或科學文獻著手獲得 已知蛋白的序列表，實驗的關鍵點就是要選擇出靶蛋白的典型肽 段。MRM 最希望檢測的是穩定的肽段，所以為了減少可能的誤 差，要盡量避免用容易發生人為修飾的殘基肽段，比如：蛋氨酸 （易發生氧化反應）和半胱氨酸（易發生脲甲基化和氧化反應） 等。② 選出來的肽段序列應該是唯yi對應其蛋白質，越能提高 檢測的特異性，就越能減少對結果干擾，由于生物樣本的復雜 性，每一個肽段往往需要選擇三個離子對（母離子-子離子）所產生的信號。利用 Skyline 軟件可以便捷地從特異性的肽段構建 MRM 離子對做定量分析。③ 配適 Agilent 1290 Infinity II 液 相色譜/6495 三重四極桿液質聯用系統 (1290 LC/6495 三重四級桿) 的 Skyline 專業軟件可以智能優化肽段的保留時間、碰撞能量，并采 集出優化后的實驗結果供科學家審核，最終自動生成分析實際樣 品的實驗方法。④ 蛋白定量的實驗要求苛刻，且基質復雜肽段 碎片眾繁，因此蛋白樣品制備就成為能否成功的關鍵一步，安捷 倫 AssayMAP 可以實現對樣品精準、高通量而且可靠耐用的自動 處理。⑤ 樣品通過液相的分離和串聯質譜的 MRM 測量，⑥ 最 終結果可利用 MassHunter 定量軟件或 Skyline 軟件分析并計算 蛋白豐度。從六大模塊流程中可以看出，安捷倫肽段定量流程的 設計理念和軟件支持有*之處，其流程特點及技術優勢在下文 詳述。

基于 三重四級桿 平臺的 MRM 肽段定量方法靈敏、精確，同時具有高 重現性和高通量。隨著蛋白質組學不斷發展，在實驗室的純理論 研究已經不斷向各個應用領域滲透，越來越廣泛地應用于以蛋白 質研究為基礎的多種新興應用分析領域，諸如：生物藥物的臨床 使用、抗體藥物偶聯物 (ADC) 的研究、蛋白藥物的毒性預測等； 甚至是原來的傳統小分子分析領域，像食品安全分析（蛋白質鑒 別，過敏原分析等）、臨床疾病診斷（發現并鑒定大量功能蛋白 質和潛在疾病蛋白質標志物）、環境保護（生物毒素監測，暴露 組學等）、能源化工（生物燃料質量控制），也都出現了對生物大分子豐度測定的需要。安捷倫在 AssayMAP 樣品自動化前處理 和 三重四級桿平臺基礎之上，巧妙借助生物肽段序列的質譜信息數據庫 和數據分析設計軟件，開發出了系統性的 MRM 肽段定量方法， 從而可以高靈敏、高精密度和高效地定量分析蛋白質以及其衍生 出的肽段生物分子，獲得這些蛋白質的表達豐度，為蛋白質差異 分析提供了更可靠、動態范圍更廣的技術手段，方便生命科學家 深入了解細胞、組織或生物體的整體蛋白質動力學，為人類健康 的福祉服務。